Dr Francis Delpeyroux
Centre Collaborateur de l'OMS de Recherche sur les Entérovirus et Vaccins Viraux.
Laboratoire Spécialisé et Régional de Référence de l'OMS de la Poliomyélite
Unité de Prévention et de Thérapie Moléculaire des Maladies Humaines. Institut pasteur. Paris
Laboratoires impliqués *
Groupe d'Etude sur les Entérovirus
du Réseau Insternational des Instituts Pasteur
1) Centre Collaborateur de l'OMS de Recherche sur les Entérovirus et Vaccins Viraux. Laboratoire Spécialisé et Régional de Référence de l'OMS de la Poliomyélite. Unité de Prévention et de Thérapie Moléculaire des Maladies Humaines, IP Paris.
2) Institut Pasteur du Maroc Casablanca.
3) Laboratoire de virologie clinique - Centre régional OMS pour la poliomyélite, IP Tunis
4) Laboratoires des Entérovirus - Centre National OMS pour la poliomyélite,. IP Algérie, Alger.
5) Laboratoire des Entérovirus - Centre régional OMS pour la poliomyélite en Afrique, IP Bangui.
6) Laboratoire de Virologie médicale - Centre National OMS de référence pour la poliomyélite - Laboratoire de Bactériologie Expérimentale, IP Dakar.
7) Laboratoire des Arbovirus/Entérovirus - Centre National OMS pour la poliomyélite, IP de Côte d’Ivoire, Abidjan.
8) Laboratoires des Entérovirus - Centre National OMS pour la poliomyélite. Unité de Virologie, IP Madagascar, Tananarive.
9) Laboratoire de Virologie, Centre National OMS pour la poliomyélite Centre Pasteur du Cameroun, Yaoundé.
Hors Zone Prioritaire
10) Laboratoires des Entérovirus - Centre National OMS pour la poliomyélite, Centre National de référence pour les entérovirus. Institut Cantacuzène, Bucarest
11) , Laboratoires des Entérovirus - Centre National OMS pour la poliomyélite, Centre National de référence pour les entérovirus. IP Hellénique, Athènes
12) - Laboratoire de la Poliomyélite - laboratoire correspondant du Centre National OMS pour la poliomyélite, IP Saint Pétersbourg.
INTRODUCTION & ETAT DU SUJET
Le poliovirus (PV) l’un des virus à ARN les mieux caractérisés est un modèle pour l’étude des virus à ARN non-rétroviraux en général, et des entérovirus (EV) en particulier. Cet entérovirus neurotrope dont il existe 3 sérotypes, pénètre chez l’hôte par la voie digestive puis atteint le SNC dans lequel il détruit les neurones moteurs, engendrant la poliomyélite paralytique. Grâce à l’utilisation du vaccin inactivé mais surtout du vaccin atténué (VPO), la poliomyélite est en voie d’éradication. Les souches du VPO induisent en effet chez les vaccinés une immunité durable et notamment une immunité intestinale qui limite la circulation du virus. Aussi, suite aux campagnes de vaccination orchestrées par l’Organisation Mondiale de la Santé, seuls quelques foyers de poliomyélite paralytique dues aux virus sauvages restent encore actifs.
Cependant ces souches vaccinales perdent rapidement leur caractère atténué en se multipliant dans l’intestin et sont ainsi à l’origine, bien que rarement, d’une maladie iatrogène, la poliomyélite paralytique associée à la vaccination (PPAV). La perte du caractère atténué des souches est due à la dérive génétique qui se caractérise par l’apparition de mutations ponctuelles qui affectent souvent les déterminants génétiques de l’atténuation (Minor, J. Gen. Virol., 1992, 73 3065). Par ailleurs, des souches recombinantes entre les différentes souches vaccinales, mais aussi entre souches vaccinales et souches sauvages sont fréquemment rencontrées (Furione et coll., Virology 1993, 196 199 ; Georgescu et coll., J Gen Virol, 1995, 76 2343; ).
Les campagnes de vaccination visant à éradiquer la poliomyélite ont pour but premier de faire disparaître les souches sauvages grâce au VPO. La dernière phase du programme d'éradication consistera à arrêter toute vaccination et à s'assurer de la disparition de l'espèce virale. Cependant, la circulation prolongée des souches du VPO chez certains vaccinés et dans leur entourage pourrait, après l'arrêt de la vaccination, entretenir un réservoir de souches pathogènes et retarder sinon compromettre le succès de l'opération.
Il est généralement admis que les anticorps neutralisants sériques protègent contre les maladies associées aux entérovirus, et plus particulièrement contre la poliomyélite. De ce fait les hypogammaglobulinémiques ou agammaglobulinémiques constituent une population particulièrement sensible à la maladie neurologique. Cependant, si l’on connaît les molécules (anticorps) qui confèrent la protection, les effecteurs moléculaires ou cellulaires qui contribuent à la clairance du virus dans l’intestin ne sont, par contre, pas encore identifiés. Curieusement cette phase ultime de l’infection n’est observée que plusieurs semaines après l’apparition des anticorps sériques protecteurs. Il est intéressant de noter que les vaccinés avec le vaccin inactivé développent anticorps et protection mais peu sinon pas d’immunité intestinale.
Les études sur l’excrétion de poliovirus sauvage en période d’épidémie indiquent que le virus est détectable dans les selles de la plupart des enfants paralysés, ou des personnes vivant à leur contact, pendant 3 à 4 semaines après l’apparition de la maladie (la durée d’incubation est le plus souvent de 1 à 2 semaines). Pendant la sixième semaine 25 % d’entre eux seulement continuent à excréter le virus (Alexander, JID, 175 S176). En ce qui concerne les souches vaccinales, les durées d’excrétion paraissent relativement similaires : 5 à 6 semaines après la vaccination le virus est encore présent chez 50 % des primo-vaccinés, cependant, dix semaines après, il n’est plus détectable que chez 1% d’entre eux (Minor, P., 1997. Poliovirus. In "Viral pathogenesis" (N. Nathanson, Eds.), pp. 555-574. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia.).
Les immunodéprimés constituent une population susceptible d'héberger à long terme des souches d'EV en général et de PV en particulier (Dowdle, JID, 1997, 175 S286). Quelques exemples ponctuels viennent étayer cette crainte. Des souches de PV d'origine vaccinale ont été ainsi isolées chez quatre patients immunodéficients, entre 12 et 31 mois après qu'ils aient été vaccinés ou infectés. D'autre part, une souche d'origine vaccinale a été excrétée pendant 7 ans par un patient atteint d'immunodéficience (CVID) qui a, au bout de cette période, développé la maladie paralytique PPAV (Kew et coll., MMWR, 1997, 46 641; Kew et coll. J. Clin. Microbiol., 1998, 36, 2893). De façon similaire un patient atteint d'immunodéficience congénitale (CVID/SCID) a développé une parésie des bras après six ans de portage chronique d'une souche de poliovirus vaccinal (Heim et coll., Xth meeting on Picornaviruses in Jena, Abstract p39). D'autre part, deux semaines après avoir reçu la seconde dose de VPO, un enfant infecté par le virus de l'immunodéficience humaine a développé une paralysie due à la souche vaccinale de type 2 (Chitsike et coll., BMJ, 1999, 318 841). Malgré le caractère inquiétant de ces quelques cas, seule une étude visant à étudier l'incidence et les modalités des infections chroniques ou prolongées à entérovirus chez les enfants séropositifs pour le virus HIV a été effectuée au Vénézuela. Les résultats mettent en évidence un portage plus fréquent d'entérovirus chez ces enfants pendant des périodes allant jusqu'à 6 mois (Liste et coll., J. Clin. Microbiol., 2000, 38 2873) Ces premiers résultats inquiétants demandent cependant à être confirmés; d'autre part l'importance du phénomène doit être évalué dans le cadre d'autres études (autres contextes géographiques, sanitaires et sociaux).
La flambée de poliomyélite qui a sévi dans les îles Caraïbes (République Dominicaine & Haiti) en 2002 a surpris la communauté scientifique (Clarke, Nature, 2001, 409 278; Greensfelder. Science, 2000, 290 1867). En effet, l'éradication des souches sauvages de poliovirus (PV) sur le continent américain, décrétée en 1993 après des campagnes intensives de vaccination avait convaincu les instances sanitaires et scientifiques de la possibilité d'éliminer poliomyélite et poliovirus de la planète; cette vision était malheureusement à courtes vues. Surprenant et inquiétant est de savoir que le virus à l'origine de cette épidémie est un virus d'origine vaccinale (12 cas confirmés, 36 cas en court d'étude) portant non seulement de nombreuses mutations mais de surcroît des séquences inconnues issues de poliovirus ou d'autres entérovirus et acquises par recombinaison génétique. De plus, des cas similaires de poliomyélite dues à la circulation de virus d'origine vaccinale (32 cas répertoriés) ont été rétrospectivement diagnostiqués en Egypte (WHO Geneva, Week. Epid. Records, 2001, 76 25.).
La mise en évidence spectaculaire d'une des propriétés essentielles d'un vaccin atténué pour la vaccination de masse, sa capacité à interférer avec la circulation de souches virales sauvages, met paradoxalement en exergue son aspect le plus problématique : les souches virales vaccinales conçues par l'homme et répandues en masse dans l'environnement peuvent dans certaines conditions entretenir un réservoir de souches pathogènes. Les efforts conjugués en recherche fondamentale et appliquée qui ont permis d'envisager l'éradication de la poliomyélite restent plus que jamais indispensables pour concevoir outils, stratégies et contrôles en vue de poursuivre une tentative déjà bien engagée. Du résultat de l'opération dépendent maintenant l'utilisation extensive et la conception futures des vaccins vivants.
Avec la mise en place de réseaux de surveillance virale et la disparition dans beaucoup de pays des souches sauvages de poliovirus, les "entérovirus non poliovirus" (ENPV) prennent une importance croissante en tant qu’agents pathogènes humains. Parfois associés à des maladies diverses bénignes (syndromes pieds-mains-bouche) ils sont impliqués dans 80% des méningo-encéphalites virales ou d'autres maladies sévères telles que les cardiopathies, pancréatites et conjonctivites hémorragiques. Ils sont la cause d'épidémies fréquentes. Taïwan a été le siège en 1998 d’une épidémie à "Entérovirus 71" se caractérisant essentiellement par un syndrome pieds-mains-bouche (1,5 million de cas estimés) mais fréquemment aussi par des complications sévères hémorragiques, d'oedèmes pulmonaires et d'encéphalites parfois mortelles (400 cas neurologiques graves). Par ailleurs, des épidémies de méningites aseptiques ont été déclarées ces dernières années en Europe (plusieurs milliers de cas en France durant l’été 2000).
Même si l’objectif semble encore lointain et difficile à réaliser, la disparition de l’espèce poliovirus reste le but ultime des campagnes d’éradication. Dans l'hypothèse où cette espèce virale serait éliminée, comment peuvent évoluer les autres entérovirus qui occupent la même niche écologique ? Occupée jusque-là intensivement par les souches vaccinales elle serait en effet alors libre. L'évolution des entérovirus reste un secteur mal connu. Quels facteurs viraux permettent à des souches circulant à bas bruit de devenir des souches hautement épidémiques et/ou pathogènes ? Par ailleurs, les entérovirus animaux pourraient représenter une menace pour l'homme.
La mise en place d'une surveillance efficace permettant d'étudier la circulation des entérovirus et de repérer toute épidémie ou maladie nouvelle liée à ces virus s'avère plus que jamais nécessaire
Objectifs du programme SCIENTIFIQUE*
1 Etude de la circulation et de la variabilité génétique des souches du Vaccin Polio Oral
Deux axes principaux ont été définis pour cette partie du programme:
a) L’étude génétique des souches vaccinales:
i. impliquées dans les paralysies flasques aiguës (PFA)
ii. isolées chez leurs contacts
iii. isolées dans des conditions épidémiologiques inhabituelles
b)* Déterminer la cinétique de la dérive génétique des souches chez les vaccinés immunocompétents.
2 Circulation des souches d’entérovirus non polio
Deux axes de développement et de recherche sont proposés :
a) Inventaire des souches d’entérovirus non polio (ENPV) par sérotypage.
b) Séro/génotypage de souches représentatives d’ENPV (nouvelle méthode moléculaire) Dans un 2ème temps, une étude plus approfondie sera menée, grâce à la technique de séro-génotypage, sur des souches représentatives isolées au cours des 5 dernières années. Cette étude permettra de populariser la méthode de séro-génotypage, de déterminer sérotype et/ou génotype en circulation dans les différentes régions considérées et, éventuellement, moyennant approfondissement, de mettre en évidence de nouveaux sérotypes.
* indique des objectifs retenus uniquement par certains laboratoires
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Compte rendu sur l’organisation et le déroulement du cours
«Diagnostic et Phylogénie Moléculaire des Entérovirus»
Bucarest 2-11 décembre 2003.
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Resumé
Le cours «Diagnostic et Phylogénie Moléculaire des Entérovirus» qui s’est tenu à Bucarest du 2 au 11 décembre 2003 a été organisé et soutenu par l’Institut Pasteur (Paris) et l’Institut Cantacuzene (Bucarest). L’objectif de ce cours était de développer et de standardiser des techniques de diagnostic et d’analyse moléculaires des entérovirus, afin de parfaire les compétences des laboratoires concernés. Dix-sept participants ont bénéficié de l’enseignement dispensé. Tous sont membres du personnel des laboratoires du «Groupe Entérovirus» qui rassemble une dizaine d’équipes impliquées dans la surveillance des entérovirus en général et de la poliomyélite en particulier. L’acquisition de ces technologies permettra d’une part de renforcer la crédibilité et la réputation des laboratoires du RIIP vis à vis des instances internationales, notamment l’Organisation Mondiale de la Santé, et d’autre part de mener à bien le programme d’étude «Entérovirus» du projet «Résistance aux anti-infectieux».
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Organisation
Le cours «Diagnostic et Phylogénie Moléculaire des Entérovirus» a été organisé conjointement par l’Institut Pasteur de Paris (IPP) et l’Institut Cantacuzene de Bucarest (ICB)à l’initiative du Groupe Entérovirus du Réseau International des Instituts Pasteur (RIIP)et du Centre Collaborateur OMS de Recherche sur les Entérovirus et Vaccins Viraux (CCOMS-REVV).Le «Groupe Entérovirus» rassemble 12 laboratoires impliqués dans la surveillance des entérovirus en général et de la poliomyélite en particulier (WHO Polio Lab Network).
Le cours a pu être organisé grâce au financement de
- l’Institut Cantacuzene via son centre d’enseignement Jacques Monod qui a fourni les locaux, le personnel d’entretien, le matériel d’enseignement et les dépenses afférentes.
- L’Institut Pasteur de Paris via la Direction des Affaires Internationales et le Département Ecosystèmes et Epidémiologie des Maladies Infectieuses.Les fonds utilisés ont été ceux alloués à la composante « entérovirus » du programme «Résistance aux anti-infectieux » d’une part par le Fond de Solidarité Prioritaire du Ministère Français des Affaires Etrangères et d’autre part par les fonds propres de la Direction des Affaires Internationales de l’IPP.
L’organisation des envois de matériel, des voyages et du séjour à Bucarest s’est déroulée sans problèmes majeurs grâce aux actions concertées
- du service d’expédition internationales de l’IPP
- du service voyage et missions de l’IPP
- du centre d’enseignement Jacques Monod de L’ICB
- du gestionnaire du site BDGNR de l’IPP
Organisation scientifique :
L’organisation scientifique du cours a été assurée par le personnel du CCOMS-REVV de l’IPP et du laboratoire de Biologie Moléculaire de L’ICB qui ont contribué à la définition et à la mise en place du programme, ainsi qu’à la préparation de la documentation et du matériel biologique pour les travaux pratiques.
Voir Annexe 1 pour la liste des personnes ayant contribué à l’organisation du cours
Objectifs
Les objectifs du cours étaient
- I) de parfaire les compétences des laboratoires du Groupe Entérovirus. Les 12 laboratoires impliqués participent pour la plupart à la surveillance des entérovirus en général et de la poliomyélite en particulier. Ils participent à ce titre au réseau mondial de surveillance de la maladie organisé par l’OMS. Les critères d’accréditation des laboratoires par l’OMS (remise en cause annuellement) sont particulièrement stricts et font appel à des contrôles réguliers de qualité (proficiency tests). Maintenir les laboratoires du RIIP à un niveau d’excellence demande une mise à niveau permanente de leurs cadres et agents. Cela se réalise notamment par l’acquisition de technologies nouvelles et par une utilisation rationnelle et critique de celles-ci.
Donner aux membres des laboratoires les moyens d’aborder le diagnostic et la surveillance des virus d’un point de vue «pasteurien» c. à d. non pas formater les esprits en fonction de technologies et d’un savoir acquis, mais préparer les esprits à la découverte de choses insolites, bizarres, novatrices.
II) Favoriser la réalisation de la composante «entérovirus» du programme «Résistance aux anti-infectieux».
Cette composante comporte 2 facettes différentes relatives à :
- la circulation et la dérive génétique des souches vaccinales de poliovirus.
- le diagnostic et la circulation des entérovirus non poliovirus.
Dans ce contexte–ci, le cours avait pour objectifs de :
- développer et/ou standardiser les techniques moléculaires nécessaires à la réalisation du programme d’étude,
- faire une mise au point des connaissances et techniques équivalentes disponibles dans le domaine
- faire le point sur l’état des techniques dans chacun des laboratoires impliqués dans le projet d’étude,
- faire l’état des lieux des résultats déjà acquis.
III) Engager une réflexion sur l’avenir du domaine d’étude sur les entérovirus et la poliomyélite.
Programme
Le cours a été constitué :
I) d’exposés sur
- les technologies classiques et moléculaires pour le diagnostic et l’analyse des entérovirus.
- des exemples d’application de ces méthodes basées sur l’expérience et les résultats de certains laboratoires du groupe.
II) de travaux pratiques de laboratoire visant à établir et/ou revisiter
- les techniques de RFLP permettant d’évaluer la dérive génétique des souches vaccinales,
- La méthodologie de séquençage d’ARN viral via la préparation d’amplicons par RT-PCR,
- les méthodes d’identification moléculaire des entérovirus.
III) de cours magistraux sur
- les banques de données de séquences,
- les techniques de recherche dans les banques de données,
- les techniques d’alignement de séquences nucléotidiques,
- les méthodes de phylogénie moléculaire.
IV) de travaux dirigés, applications des cours décrits en III)
V) de tables rondes sur des aspects ou problèmes méthodologiques, conceptuels ou technologiques visant à faire partager des connaissances ou expériences de chacun et à mettre en place des solutions accessibles à tous et des actions communes.
VI) d’évènements sociaux extraprofessionnels visant à parfaire la connaissance des personnes de leur pays, de leur milieu et d’accroître les liens entre les participants. Mettre en contact les «anciens» avec les «nouveaux».
Voir Annexe 2 pour le programme du cours.
Participants
Dix sept participants appartenant à 11 laboratoires du Groupe Entérovirus ont été sélectionnés pour suivre le cours. Ont ainsi été représentés 11 instituts du RIIP (11 pays d’Europe et d’Afrique)dont huit appartenant à la zone de solidarité prioritaire définie par le Ministère Français des Affaires Etrangères.
Voir Annexe 3 pour la liste des participants.
Conclusion & PERSPECTIVES
La tenue du cours «Diagnostic et Phylogénie Moléculaire des Entérovirus» a été l’occasion non seulement de faire le point sur l’état de la surveillance et des recherches dans les laboratoires concernés et de développer des technologies nouvelles mais également de resserrer des liens entre les différentes équipes et personnes. La disparité entre les équipes en termes de moyens (matériel et humain) et de technologies disponibles demandent un effort particulier de chacun et une volonté de solidarité essentielle.
Il est heureux de constater que plus de la moitié des participants étaient nouveaux venus dans le domaine. Cet aspect est particulièrement important dans la mesure où les carrières des anciens cadres évoluent et il est important que de nouveaux soient formés pour maintenir le niveau technologique et les compétences des laboratoires.
Le programme d’étude «Résistance aux anti-infectieux» semble particulièrement bien amorcé, d’autant plus que la plupart des laboratoires n’ont reçu leur financement qu’à l’automne. Il serait souhaitable qu’à la prochaine réunion (dans un an environ) les technologies nécessaires soient fonctionnelles dans tous les laboratoires et que les échanges concernent essentiellement les résultats acquis.
ANNEXE 1 - liste des personnes ayant contribué à l’organisation du cours Diagnoctic et phylogénie moléculaires des entérovirus
Organisation & logistique:
Direction de l’Institut Cantacuzene (ICB)
Marian NEGUT – Adrian ONU
Direction du RIIP
Michèle BOCCOZ – Jean-Luc GUESDON – Marc JOUAN
Centre d’enseignement Jacques Monod de L’ICB
Dan BUTUR
Service Import/Export de l’IPP
Francis DECHERON – Claude PELLE
Service Missions de l’IPP
Michele LECLERC
Service Gestion du site BDGNR de l’IPP
Clémentine USTINOV-BELLEN
Service Informatique de l’ICB
Dorin Bunea – Marian Mosteanu
Service Informatique de l’IPP
Olivier PERRET
Organisation scientifique :
CCOMS de Recherche sur les Entérovirus et Vaccins Viraux (IPP)
Sophie GUILLOT - Francis DELPEYROUX
Laboratoire de Biologie Moléculaire de l’ICB
Gabriela OPRISAN – Luminita POPA – Camelia Szmal - Maria Damian
Enseignement
Mariana COMBIESCU – André AUBERT-COMBIESCU – Odile LECOMPTE – Noël TORDO
ANNEXE 2 – Liste des participants
Natacha Romanenkova IP St Petersbourg Russie
Panayotis Markoulatos IP Athènes Grèce
Eugenia BOLANAKI IP Athènes Grèce
Ana PERSU Institut Cantacuzene Roumanie
Anda Baicus Institut Cantacuzene Roumanie
Hinda TRIKI IP Tunis Tunisie
Sondes Haddad Boubaker IP Tunis Tunisie
Soumeya BOUDJADJA IP Alger Algérie
Jala NOURLIL IP Casablanca Maroc
Ousmane DIOP IP Dakar Sénégal
Hamet FALL IP Dakar Sénégal
Edgard Valery ADJOGOUA IP Abidjan Côte d’Ivoire
Marie-Claire ENDEGUE ZANGA IP yaounde Cameroun
Ionela GOUANDJIKA IP Bangui RCA
Mala RAKOTO ANDRIANARIVELO IP Antananarivo Madagascar
Richter RAZAFINDRATSIMANDRESY IP Antananarivo Madagascar
ANNEXE 3 Programme du Cours
